毒理学研究中减少临床病理测试所需血量的考虑点

在临床安全评估中，改善动物福利是毒理学研究中广泛关注的问题，这一点得到了减少、改进和替代动物在研究和教学中使用的3R原则的支持。这些原则主张减少使用的动物数量，改善动物使用方法以减少或避免痛苦和压力，以及用非动物安全筛查替代动物使用。在临床前安全评估中，减少动物使用的主要限制是需要采集足够的血液来评估临床病理（CP）、毒代动力学（TK）和其他由监管机构作为药物提交包的一部分所要求的终点。微量采样，定义为采集少于100微升的血液量，已在TK分析中被推广和成功实施，以通过减少血液需求来最小化使用啮齿动物。也考虑将类似的低血量采集实践应用于CP评估。目前没有指南和很少的出版物讨论将微量采样应用于毒理学研究中的CP测试。这个工作组的目标是审查当前的血液采集和采样实践，用于临床前毒理学研究中的CP测试，并讨论被提出的减少血液量需求和动物使用的方法的优缺点。特别关注啮齿动物，因为这些物种更频繁地遇到血量限制。本文介绍了一个行业范围内关于CP仪器和实践的调查结果，并基于实验室实践和来自支持制药和生物技术公司的临床病理学家的意见提出了建议。

讨论的主题包括：(1) 样本分析仪器要求，(2) 小型、低通量分析仪在临床前研究中的效能，(3) 样本混合和稀释方法的缺点，(4) 采血技术，(5) 使用小规格采血管的考虑，(6) 微量采样在TK与CP中的效用，(7) 研究设计考虑及其对CP结果的影响。

在临床前安全评估中，血样用于评估TK和CP变量以及其他生物标志物。用于CP评估（血液学、凝血和生化学）的血样必须在重复剂量研究的所有动物中在研究终止时收集，并且也可能在亚慢性和慢性研究的中间时间点收集。在小鼠中，中期CP终点的评估需要额外的动物，因为几乎需要收集小鼠的总循环血容量（对于一个25g的小鼠约为1.8mL）进行分析，而在解剖时从单个小鼠可收集的总血量通常< 1mL。

监管指南没有明确规定CP测试所需的血液量，而是提供了要评估的终点的指导。在临床前研究中，还收集血样以评估化合物的TK特性，评估药物暴露、代谢产物生成和反复剂量后的生物积累潜力。TK分析需要在整个研究期间的多个日子里，以短间隔收集多个血样，持续24至48小时。从动物身上取血的总量受各机构动物保健与使用委员会（IACUC）的政策约束。

与血液测试的最小量要求类似，生化测试所需的最小血量主要由分析仪的要求和获得足够重复分析样本的需要以及技术限制所决定。在17位受访者中，最常用的生化分析仪是BeckmanAU系列（17位中有5位），Advia 1200/1800（17位中有5位），和Roche/Hitachi Modular（17位中有4位）；较少见的有Abbott Architect、Roche Cobas 6000，和Siemens Dimension（各1位）。由于对Hitachi modular仪器的制造商支持即将在2017年末在北美停止，几位受访者表示他们可能会转换到Roche Cobas 6000；因此，这种仪器将来可能会变得更受欢迎。一个单独的生化运行所需的最小样本量在不同的分析仪之间有所变化，范围从100到750微升的血清（相当于大约0.3-2.0毫升的全血）。特定的血清或血浆体积要求从150-400微升（Beckman AU仪器）到135-750微升（Hitachi P800），120-250微升（Advia 1800），185微升（Abbott Architect），到100微升（Roche Cobas 6000）。最低所需体积在不同仪器间大体相当（100-185微升的血清或血浆）用于一个完整的生化Panel的单次运行。制造商关于分析仪最小样本体积要求的信息不具体且稀缺，来源显示根据单个测试的需要，范围从1到40微升不等。尽管大多数个别测试需要的血清或血浆量≤5微升，一些测试特别需要大量的体积，包括电解质（高达40微升），山梨醇脱氢酶（SDH）（高达15微升），铁（高达20微升），和肌酐（高达20微升）。与血液测试的最小量要求相似，这些体积没有考虑到额外的体积，这是为了验证或超出线性分析（即重复运行），以及与移动和回收小样本体积相关的挑战。因此，重复分析的首选体积范围从250到1500微升的血清或血浆（约0.75-3.5毫升全血），一些机构因研究设计和技术可行性的因素而从大型动物中请求更高的体积。

对于CP测试的样本预稀释的验证需要不仅仅是对稀释线性的简单声明。手动稀释样品中产生的总分析误差必须与验证为未稀释样品的可接受最大误差相当。总分析误差是随机误差（在重新测试样品之间观察到的变异系数）和系统误差（稀释和未稀释样品之间的偏差）的总和。总误差的可接受性对于解释CP结果的变异性（分析性和生物学性）至关重要。分析方法的不精确性应低于生物变异性定义的最大不精确性。如果不是，由于测试物、生物变异性和分析误差的原因而导致的变化无法区分。例如：使用5%的方法不精确性（CV）测量的ALT活性为100 U/L，测量不确定性（SD）为5 U/L，测量范围为的均值±2SD，即90-110 U/L，被认为是相同的。因此，任何小于等于20 U/L的测试物相关或生物效应都无法与分析变异性区分开来。如果手动预稀释产生了15%的CV，则70至130 U/L之间的值被认为是相似的，因此60 U/L以下的变化可能是由于分析变异性引起的，不能归因于测试物相关。

广泛采用预稀释进行CP测试的一个重要障碍是可能通过基质干扰或对酶活性的影响引入分析误差，这些影响依赖于浓度、pH和/或其他生理化学变量。基质干扰现象在免疫分析中最常见，但在使用标准分光光度生化方法时也可能出现。一些基质中存在的蛋白质、抗体和其他物质（例如，测试化合物及其代谢物）（例如，血清、血浆和尿液）可能通过多种机制干扰分析性能，包括分析物与蛋白质/膜结合或交叉反应抗体相互作用。干扰基质组分最常导致分析抑制或分析物浓度低估（负偏差）; 但在某些情况下，根据相互作用的确切性质，可能会发生分析物浓度高估。干扰分析性能的内源性基质物质通常通过建立分析/基质的 minimum required dilution（MRD）最小稀释倍数来克服。样品被预稀释至足以克服干扰的比率，但在可测量范围内。然后，所有样品在分析之前都被稀释到建立的MRD。

有在标准的CP程序下，因改变基质或样本状态导致阳性结果的报道。在猪血清样品中观察到了LDH活性的增加（从纯样品到1:10的连续稀释，A.A.，未发表观察结果）。目前尚不清楚这种现象的原因，但可能与酶的四聚结构解离为单个酶活性亚基有关。体外研究表明，一些酶在解离为亚基后的活性等于或大于完整的多聚体分子。因此，改变生理样本条件（例如，稀释、pH、温度、储存时间）可能导致酶活性增加或影响这些测量的准确性是合理的。

关于血液学的预稀释的研究通常使用盐水、仪器试剂（例如Advia上的清洗剂、Sysmex上的Cell pack）或细胞培养基稀释抗凝血。由于红细胞细胞膜是柔韧且非弹性的，如果稀释液不是等渗的，红细胞的形状和大小会发生变化，因此会改变红细胞指数。保持红细胞形状和完整性的适当渗透压因溶液而异。

在比较稀释和未稀释血样的研究中，观察到的血小板计数的变异性是重要且意外的。稀释后观察到的血小板计数的大变异性被归因于稀释过程中血小板的凝集或解凝。血小板是反应性细胞；它们容易被激活并可能凝聚，导致分析不准确。

许多生化分析物可以稀释。然而，对于一些测试，样品不能稀释超过50％（例如，白蛋白和总胆红素）或70％（电解质），因为稀释可能会将浓度降低到检测下限以下。电解质应在去离子水中稀释，因为盐水含有钠和氯。

对于凝血变量的测量，血浆不能进行稀释。凝血时间的稀释线性研究产生了较差的恢复结果。实际上，凝血时间高度依赖于大量组分和存在于高度特定浓度的凝血因子之间的相互作用来评估凝血级联。凝血时间以秒为单位测量，并不是与各种凝血因子浓度本质上线性相关的。因此，为了减少血液体积要求，用于凝血时间的血浆在任何情况下都不能稀释。

如果被认为适合目的研究（分析误差被认为是可以接受的），手动预稀释可能被用于探索性研究环境中。然而，根据本工作组的看法，手动预稀释不适合支持临床试验的临床前安全性研究。

调查要求提供关于每种主要实验动物种类（大鼠、小鼠、非人灵长类动物和狗）在中期和末期采集使用哪些静脉采血部位的信息，以及可能限制血液量的情况（例如，中期或存活期间）。来自13个机构的调查提供了与本节相关的信息（见表2）。工作组还审查了低体积血液采集的血液采样技术。

根据种类、体积需求和采集频率以及是末期还是存活程序的不同，可以使用几种不同的血液采样技术。对于末期程序，除了小鼠外几乎种属都可以通过解剖放血收集到全部循环血量，因此可以收集到足够的血量进行完整的CP检测。对于存活动物，最大允许的采血量因机构而异，但通常限制为从健康的未受损动物身上每7天采集循环血量的7.5%。总循环血量可以估算为每公斤体重55-70毫升，或达到总体重的10%，尽管老年或肥胖动物往往较低。不同种类的循环总量也存在差异：兔（44-70毫升/公斤）、大鼠（58-70毫升/公斤）、恒河猴和短尾猴（分别为44-67毫升/公斤和55-75毫升/公斤）、迷你猪（61-68毫升/公斤）、小鼠（63-80毫升/公斤）和比格犬（79-90毫升/公斤）。动物福利问题和预防发病是这些建议的主要原因。然而，从动物福利角度来看，移除被认为是可以接受的血液量仍可能影响随后的CP结果，并且在不健康的动物中，这种影响可能会加剧。因此，从CP的角度来看，血液损失和体积减少对数据解释的生理后果是重要考虑因素，即使血液量在IACUC接受的限制范围内。

非啮齿动物（NHP和狗）

调查中几乎所有受访者都表示他们从猴类的股静脉（87%）和狗的颈静脉（76%）收集末期和中期（存活）血液样本。猴类和狗也偶尔使用腓静脉，而狗中较少使用桡静脉。可以使用注射器和针头、导管或巴斯德管和毛细管管收集血液。

虽然狗和猴子的血液量充足，微量取样并不是关键问题，但由于反复进行TK、药代动力学（PK）、抗药物抗体（ADA）、CP等多次血液采集，可能会导致不良的程序相关效应。这在猴子身上尤为明显，因为与狗（79-90毫升/公斤）相比，它们的循环血量较低（44-75毫升/公斤）。在从大型动物收集血液时，采血者通常更喜欢使用真空管，因为它们易于使用。真空管通常提供1.4-2.0毫升的管子，这比分析器所需的体积要大。因此，通过使用可能的最小管子来减少从猴子收集的血液量是有价值的。

 啮齿动物（大鼠和小鼠）

末期采集通过针头和注射器或导管进行
在啮齿动物中，可以通过使用针头和注射器或导管从麻醉动物的大血管中抽取大量血液，在研究结束时进行末期采集。对于大鼠的常规末期采集，大多数调查受访者（78%）表示，在尸检时，用于CP测试的血样是从下腔静脉或腹主动脉抽取的，而17%的实验室表示使用了颈静脉。对于中期/存活出血或血量有限的情况，样本最常见地是从尾部（44%）、颈静脉（31%）或舌下静脉（19%）抽取。一些实验室指出，在从啮齿动物的尾部采集时，他们使用尾部加热盒，有时会进行尾部切割。至少有3个机构（17%）表示他们仅在大鼠的末期和中期采集中使用颈静脉，而5个实验室（31%）使用舌下静脉。随着动物福利标准的不断提高，使用历史上流行的后眼窝窦/网状窦的趋势逐渐减少，而鼓励使用其他采集途径；一家实验室表示他们从大鼠的后眼窝网状窦采集。据报道，静脉采血部位经常影响CP终点，强调了在给定研究中保持一致性的重要性以及对特定部位的历史控制范围的需求。在小鼠中，常规的末期血液采集大多来自下腔静脉和腹主动脉（56%），或通过心脏穿刺（31%）在尸检时进行。体积较低的中期和存活出血（≤250微升）通过各种方法和部位进行，包括尾部（38%）、颈静脉（15%）、面部（23%）和舌下静脉（15%）。有两个实验室表示他们从小鼠的后眼窝窦采集。

在麻醉动物（例如，异氟醚、二氧化碳等）的腹腔打开后，从下腔静脉或腹主动脉中抽取血液，然后在尸检前对动物进行安乐死。可以进行部分失血，从而收集大量血液（大鼠约10-15毫升，小鼠最多可达1毫升，具体取决于啮齿动物的大小和心脏是否在跳动）。重要的是要理解，特定麻醉方案对CP结果的影响可能是显著的（例如，使用二氧化碳时，钾和葡萄糖增加）。心脏穿刺只在深度末期麻醉下进行，或对任何物种的安乐死动物进行。适用于凝血变量和心脏（肌钙蛋白）和其他肌肉损伤生物标志物（CK、AST）之外其他所有CP变量。的确，将针头穿过心肌会释放心肌酶，并影响它们的评估；它还会释放组织因子，引发凝血并影响凝血时间的评估。

啮齿动物非末期采集通过针头和注射器或导管

对于非末期（中期或存活）采集，使用针头和注射器或导管进行血样采集是首选方法，因为它可以快速收集大量血液。导管插管是一个有吸引力的选择，因为它可以减少与重复束缚和针刺相关的压力。然而，有必要密切监测动物并在采血间固定导管。用于啮齿动物的血液采集使用无菌的23到29号针头或蝶形导管。针头的孔径应尽可能大，以确保迅速抽取血液而不会导致静脉塌陷；它应略小于血管的直径，以避免血肿。针头可以连接到注射器，或者血液可以被动地收集到试管中。在刺穿部位之前可以用酒精擦拭以帮助定位静脉。

啮齿动物的注射器血液采集的首选部位是颈静脉或舌下静脉，因为经过训练的技术人员可以从这些部位迅速地从大量未麻醉的动物（例如大鼠、小鼠和仓鼠）中高质量地采集血样，而且所需设备很少。这些采血部位非常适合低体积的多次血液采集，并可用于末期或非末期CP测试。此外，据报道，与从眼窝后部静脉网状窦（眼窝窦）采样相比，这些方法对动物的应激程度更低，对组织损伤也更少。舌下静脉采血后观察到的组织学病变通常包括轻度至中度的出血，有时伴有舌部炎症，偶尔有肌肉或血管损伤。这些次要的发现通常不会混淆试验物相关效应的解释。食物摄入量和体重增加并未减少，并且临床出血和舌部肿胀很少需要干预。关于检验舌下静脉采样对CP终点的影响的受控研究有限。从眼窝后部静脉网状窦和舌下静脉采样的CP终点的比较显示几乎没有显著差异。一些明显的趋势包括在眼窝后部网状窦采样中增加CK和AST活性，以及在舌下静脉采样中增加淀粉酶活性。这些发现表明，眼窝后部网状窦采样样品中的组织或肌肉损伤增加，并且从舌下静脉采样时可能存在唾液污染的可能性。

对于收集少量血液（即200-300微升）的尾静脉采集，使用针头是合适的，但血凝块经常发生（见附录）。由于发现其造成的疼痛和压力较小，并且不会造成永久性损伤，因此下颌下静脉穿刺在小鼠中经常使用。当处理者熟练时，这种方法是迅速的，可以从小鼠中获得>300微升的血液，并且在将小鼠放回笼子时似乎对小鼠造成的压力或不适感较小。

 啮齿动物毛细管或移液管采血

可以通过皮肤切口或粘膜组织的小切口使用毛细管或巴斯德管进行血液采集。通常可以收集的血液体积范围为毛细管管中的全血20到150微升，巴斯德管最多可达500微升。使用毛细管采血可用于TK血液采集，但不建议用于啮齿动物的常规或自动化CP评估，因为预期的程序相关变量可能会发生改变。在非常规研究中进行有限的评估是可能的，但数据必须谨慎解释。毛细管管可以涂有肝素或EDTA，但是从毛细管管中转移血液非常困难，血液应该从毛细管管中处理。巴斯德管可收集更多的血液，并将其转移到试管中进行常规分析。

在非常规研究中使用毛细管管采集血液，可以使用一滴血制备血涂片，从中可进行总白细胞计数和分类白细胞计数，另一滴血可以用于制备网织红细胞涂片（抗凝血的血液与新亚甲蓝染色液混合），以手动评估网织红细胞百分比相对于成熟红细胞。在将毛细管管放入微量离心机离心后，可以确定PCV，并收集血清或血浆。管子在血小板和血清/血浆交界处被切断和打破，通过轻轻敲击切断的管子将血浆/血清收集到较大的容器中。可以通过折射计测量蛋白质浓度，但是获得的血浆/血清体积（收集的150微升≤ 80微升）通常不足以在自动分析仪上测量临床生化变量。

在小鼠和大鼠中，毛细管采样的首选部位是尾部、后眼窝窦/窦和下颌下静脉，尽管由于皮肤切口而导致异常凝血指标的啮齿动物可能出现过度出血。有关动物处理和采样方法的描述见附录。尾静脉毛细管采样是重复小体积血液采集的首选方法，例如葡萄糖耐量测试，因为初始采血后尾部形成的结痂可以在几分钟后轻松除去，并且血液可以再次从同一部位收集。后眼窝窦/窦采样是通过用毛细管管或巴斯德管穿透后眼窝窦/窦来进行的。尽管这种方法在麻醉动物上进行时速度较快，但近年来由于显著的动物福利问题，越来越少地使用这种采集部位在啮齿动物中进行（不建议采用）。

分析前变异可能会影响小量血液的结果，特别是在小鼠和大鼠中，因为在这些物种中更频繁地遇到血液采集困难。为了限制分析前变异，应该标准化程序，并由受过适当培训的人员执行。应该在研究或一系列可比较的研究中始终保持一种血液采集方法，以减少由于血液采集实践的差异引起的变异。由于血液采集部位、限制、麻醉和禁食状态的差异，可能会观察到生化和血液学值的差异。动物可以用限制器限制，但通常更喜欢手动方法，因为这些方法更快且最小化动物压力（见附录）。有意识的啮齿动物可以放置在恒温加热箱中一小段时间以扩张静脉，或者只加热动物的一部分，例如尾部。在麻醉的动物中，由于麻醉剂的作用，血管扩张可能会发生，因此可能不需要加热。在血液采集前30分钟可以在部位上涂抹麻醉霜。可以收集肝素化血浆或血清进行临床生化测试，但是据报道，肝素化血浆或血清中测量的变量之间存在差异，因此评估应该在整个研究期间使用相同的基质，并且应使用相同的试管。一些研究者更喜欢只收集一份肝素化样本进行血液学和临床生化测试，以减少血量；然而，使用肝素化血液可能会对某些血液学变量如血小板计数的结果有效性产生负面影响，而EDTA仍然是血液学分析的抗凝剂选择。适用于各种物种的血液学仪器和及时分析新鲜血液是减少分析前血液学误差的必要条件。理想情况下，应在采集后4小时内制备血片，并在相同时间间隔内对样本进行分析，或者将其冷藏不超过24小时以适用于小鼠和大鼠样本。稳定时间表应在验证方法期间由每个实验室确定。

对使用小容量采集管的考虑

根据调查结果，大多数凝血分析仪器可以使用约150–200微升血浆进行包括活化部分凝血时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）在内的Panel测试，重复分析则需要两倍于此的血浆量。然而，考虑到需要1:9的柠檬酸盐与血液的比例，任何试图减少凝血测试所需血液量的尝试主要受到商业上可获得的柠檬酸盐血管（例如0.5毫升、1.0毫升、1.3毫升和2.0毫升）尺寸的限制。事实上，对于毒理学研究，血液不是直接在柠檬酸盐注射器中采集的，因为血液学、生化学和凝血测试是从同一次血液采集中进行的。此外，使用商业抗凝血管比使用实验室制备的添加抗凝剂的管子引入的变异性较小。几家制造商提供500微升的柠檬酸盐管（例如Sarstedt、Greiner Bio-one）。这些管子含有50微升柠檬酸钠，为了保持1:9的比例以避免对凝血变量产生影响，需要收集450微升的血液。对于较低的体积，可以向精确的血液量中加入计算的柠檬酸盐溶液，但由此得到的血浆量可能不足以评估完整的凝血Panel。在大鼠中，对于健康大鼠，500微升的柠檬酸盐管在离心和分离后将提供210–260微升的血浆，而对于脱水的动物，产量甚至更低。了解到大多数凝血分析仪器需要150–250微升的血浆来测量PT、APTT和纤维蛋白原浓度，500微升的柠檬酸盐采集可用于评估完整的Panel，但在需要时留下有限的残余量重复测定。作者还发现，与1.0毫升或1.3毫升的较大管子相比，500微升的柠檬酸盐管样本凝固的频率更高（FP，未发表观察结果）。凝固样本的数量与柠檬酸钠浓度（3.2%或3.8%）无关，但取决于执行速度和血液采集的容易程度。

血清和EDTA血液采集的0.5毫升采血管

对于血清采集，可以使用500微升血清分离管（SST）管收集低至100微升的血液。即使体积很小，仍可通过离心分离，但需要使用巴斯德玻璃移液管将血清与凝块分离。与液体K3 EDTA管相比，使用粉末K2 EDTA管总是更可取，以限制抗凝剂对血液的稀释。可以在500微升K2 EDTA管中收集低至100微升的小体积，而不会影响血液学变量，尽管红细胞形态学可能会因EDTA过量而稍有改变，如棘形红细胞易于形成。

在使用小容量管时，必须特别注意血液采集实践。快速将血液转移到抗凝管中对限制血液凝固和柠檬酸盐管的污染至关重要。为了限制血液凝固，从注射器到管子的首选填充顺序如下：首先填充柠檬酸盐管，然后是EDTA、肝素、SST，最后是非抗凝管。必须立即将管子盖好并反复颠倒数次。最好指定一个技术人员负责血液采集和填充管子，另一个技术人员负责盖好和反复颠倒管子。一些制造商建议在使用500微升小容量管时精确进行颠倒的次数（例如，肝素和氟化物管为10次颠倒，EDTA为8–10次颠倒，SST为5次颠倒，非抗凝管不需颠倒）。作者也认为，在使用任何品牌的小容量管时，应执行类似数量的颠倒次数。

毛细管微量移液器由连接到管子的毛细管组成（例如，微量移液器 200 K3；Sarstedt，Numbrecht，德国），设计用于收集小体积，例如 100 和 200 uL。这些对于 TK 样品很有用，但对于 CP 测试没有用，因为如此小的体积很难在不稀释收集的血液的情况下进行分析。

微采样技术用于TK分析

毒代动力学评估需要在24小时内（小分子药物）或数天至数周内（具有较长半衰期的大分子/生物制品）进行多次连续血液采集（通常为4–8次）。虽然传统的分析TK方法每次需要多达1毫升的血液，但最近的分析技术进步显著降低了TK分析的血液量要求，从而为TK血液采集的微采样开辟了可能性。

用于TK分析的主要微采样技术是毛细管微采样（CMS）。毛细管微采样使用精确的血液或血浆体积（1–25微升）在毛细管或吸管中采集，然后将其稀释进行生物分析。毛细管微采样与传统的大体积采样不同，因为微样品在任何处理和分析之前都被稀释，重复分析是使用稀释后的样品进行的。必须考虑分析灵敏度以选择适当的体积。描述了使用25微升血液或8微升血浆的CMS分析方法。类似于传统生物分析方法的CMS方法的验证被发现具有良好的一致性精度和准确度，并且现在用于关键的动物安全研究；它需要进行一两次额外的稳定性实验，并且在稀释过量样品、ISR以及批次失败后重新分析方面的程序略有不同。

尽管未被广泛采用，但用于TK或PK和药效学（PD）评估的微采样已被证明是安全研究中动物使用的改进和减少的可行方法。根据在伦敦由国家3R动物替代、精简和减少研究中心（NC3Rs）主办的研讨会上收集的80家公司的33名代表的发布结果，微采样主要用于PK研究中的TK分析或发现或剂量范围研究。微采样在进行一般毒性、安全药理学或遗传毒理学的GLP研究中使用非常有限。此外，预会议问卷显示，不同公司对所有物种使用“微样本”一词的定义范围很大（< 25微升至> 100微升），而“微样本”的定义在不同物种之间可能有所不同，特别是在啮齿动物和非啮齿动物之间。

将TK和CP测试结合在同一队列中

对啮齿动物数量的最大影响来自TK分析样本的采集。在监管研究中通常更倾向于使用单独的TK队列，以确保耐受性，防止危及毒性终点，并最大程度地提高检测到微小CP变化的能力。连续TK采样最适合评估随时间发生的个体动物变化，但需要从每只动物中收集大量累积的血液量，通常需要单独的TK卫星动物。组合（稀疏）采样可减少每只动物采集的总血液量，但需要更多的动物。

一些研究人员提出通过从主要研究动物中采集复合TK微样本来完全取消TK队列，当分析灵敏度允许并且研究中有足够数量的动物/组时。除了减少动物使用和化合物需求外，这种方法还使得可以直接确定主要研究毒性动物的暴露情况，从而允许在个体动物中进行暴露和毒性的相关性（改良）。当药物暴露或分布在同一组动物中不一致时，这一点尤其重要。然而，在同一队列的动物中测量TK和CP存在增加预分析变异性和掩盖试验物相关效应的风险，因为由于反复采集血液和与小体积样本采集相关的技术挑战，耐受性降低。

一些研究人员评估了TK采集对大鼠CP变量的影响，并报告了通常由于反复操作（轻度应激白细胞增多）或先前的血液采集（较低的红细胞质量，增加的网织红细胞计数）而导致的最小效应。在成年和幼年大鼠中进行TK微采样测试导致血红蛋白浓度略微下降，单核细胞计数略微增加，以及体重增长略微减少。在24小时内从大鼠的腓静脉采集6个时间点的血液体积为200微升导致红细胞质量下降。此外，无法一致地为所有时间点获得这个血液量，且取样经常与采血部位的血肿有关。成功获得较小体积（50微升或100微升）的血液样本而没有任何问题，并且不与重要的血液学变化相关联。在大鼠中连续24小时收集多达1.2毫升（每次200微升，共6个时间点）的血液量，长达一个月，不会干扰监管毒性研究中的毒性评估。通常情况下，预期的与程序相关的效应可能包括降低的红细胞质量和网织红细胞计数，伴随着脾重量增加和脾外骨髓造血增加。其他报道的效应包括尿素的轻微降低和钠的增加。从毒性动物收集TK血液可能引起再生性造血反应，可能掩盖微小的试验物相关的造血毒性，通常被检测为网织红细胞计数下降。基于药物效应、造血反应和临床/耐受性影响的可变性，不建议在预期存在造血毒性或血液动力学效应或推高剂量耐受性时对毒性动物进行TK采集。此外，这些方法可能不可行，或者可能需要进行修改，以适应其他生物标记物分析（例如PK/PD分析，ADA评估，T细胞依赖性抗体反应[TDAR]和其他非常规毒性生物标志物）或连续采样。TK采集对主要研究动物的血液学测试的影响可以通过在TK采集之前进行血液学采样，并在TK采集后（在或在剖检时）进行生化学和凝血学采样来减少。

修改研究设计以优化CP采集

为了限制血液量需求并消除卫星TK组的需要，可以减少TK血液采集的次数和数量。对于CP评估，类似的方法不太可行，因为这些受到监管要求的限制，所需的时间点数量通常已经很少了。然而，可以通过在早期的初步研究中获得的信息来减少给定研究所需的CP时间点数量。另一个选择是在治疗空窗期间排除测试，如果在剂量结束数据评估后发现这些测试不是必要的。然而，这种做法在减少血量方面的效果有限（除了需要额外的一组小鼠），因为可以在剖检时收集到更大的样本量。允许采集更大体积样本的另一种方法是使用较大的动物，同时减少动物数量。当不预期试验物效应存在性别差异时，有些人可能会考虑仅使用雄性动物，因为雄性动物的体重和血容量比雌性动物更大。同样，增加大鼠的年龄以在研究开始时收集大量样本，这样在第一剂给药后的一到两周内需要重复血液采集以评估初始暴露情况或PD反应。将大鼠的给药起始年龄从6周延长至12周将使得可收集的血液量增加1.5–2.0倍，即使在慢性研究（长达6个月）的情况下也是可以接受的。6周和12周大鼠之间的血液量差异在小鼠中不太明显。在这种物种中，通常会使用单独的动物队列，以获取足够数量的血液来测量所有血液学和生化变量。小鼠研究中很少进行凝血剖面，或者应该将其限制在末期血液采集中。减少研究中评估的变量数量在减少血量方面效果有限，因为血液学终点都是在相同的预定血量分析中进行测量的。临床生化终点可以优先考虑，但大多数终点应该被测量，以避免危害研究的科学完整性。在对啮齿动物进行早期调查时，电解质可以从生化Panel中删除，以减少收集的血量120–150微升。有些人可能会考虑将所需的血量限制为分析器所需的最低体积，但收集足够的血液以便于对初始数据进行验证是CP评估的核心基础。在非验证分析产生的风险被接受且不被视为关键的情况下，可能可以将血量要求降低到仅满足一次分析所需的程度。在这种情况下，应在血液学分析之前准备血液涂片以通过显微镜评估任何异常，并确保使用经过适当验证和质量控制的仪器。

附录：啮齿类动物采血方法

1.    大鼠颈静脉采血 血液取自肩胛骨下的一个小三角形区域。通过颈静脉采血，可以从大鼠收集0.1至3mL的血液，从小鼠收集最多0.3mL的血液。将动物固定在一个手的胸部周围，前肢用技术人员的拇指和中指抓住，放置在二头肌水平并向动物背部推进。头部被倾斜在头部固定器中，使采样部位凸显出来。通过将针头插入锁骨下1-3毫米处，朝鼻子的方向进行采集。

2.    舌下静脉采血 将动物置于仰卧位置，握住颈部的背部皮肤（颈部的后颈部），口腔会打开，舌根的两侧将可见到2个舌下静脉，位于舌根的中线两侧。在采集血液之前，应使用纱布清洗和擦干口腔，以最大限度地减少唾液对样品的污染。使用23至25号针头穿刺舌下静脉，通过将动物悬在管子上，让血液滴入标本管中。获得所需血液后，用棉花或纱布对舌头施加压力，出血通常会在20-30秒内停止。在小鼠中，舌下静脉位于尾部，视觉上较难观察，而天竺鼠没有舌下静脉。这种技术的局限性包括在获取特定血量时缺乏控制精度（重力滴灌法），以及偶尔舌头的轻度临床影响。

3.    尾静脉 在大鼠中，可以使用21号针头进行直接穿刺，而在小鼠中可以使用24至29号静脉导管。侧面尾静脉位于尾部末端的三分之一处，向尾部基部移动以进行多次采样。一手持住尾的末端部位，将针头以斜角插入静脉。使用导管时，应将管道移除以防止血液凝结。血液被允许滴入0.5mL的管子中。这种方法可以收集小量血液，最多可达200-300微升，但是使用这种技术很难获得更大的血量。为了避免尾部瘀伤和损伤，通常在24小时内最多采集2次血样。

4.    下颌下静脉穿刺 首先，将小鼠的皮肤抓起，使颊部区域绷紧，然后使用23至25号针头穿刺皮肤，穿刺点位于眼眶和下颌-面部静脉汇合处，向颈静脉引流。当处理者熟练时，此方法速度快，可获得超过300微升的血液。

5.    终末血液收集 腹主动脉和腔静脉是啮齿动物终末采集的最常见部位。在麻醉后和开腹后，从这些部位取血。动物在解剖前被安乐死。这种类型的血液收集允许采集更大的血液容量，因为可以进行部分灌注。从大鼠中可获得10-15mL的血液样本，从小鼠中可获得0.1-1mL的血液样本，取决于啮齿动物的大小以及心脏是否跳动。心脏穿刺只能在深度终末麻醉状态下进行，或者在任何物种的安乐死动物身上进行。最好从心脏，尤其是左心室采集血样，可以通过胸部左侧，透过膈肌，从胸骨顶部或通过胸腔切开来实现。或者，也可以从右心室进行血样采集以进行静脉采样。根据动物的大小，可以收集大量血液。

毛细管/吸管采血法（啮齿动物）

注意：正如前面讨论的，尽管这种方法可用于TK研究，但不适用于临床病理学测试，也不建议使用。

1.    尾静脉毛细管采血适用于小鼠和大鼠的毛细管管采集。在采集血液前应给予麻醉或局部麻醉。将尾部浸入温水中后，使用剃刀刀片切开尾部，并在切口基部用力挤压以采集血液。这是唯一一个可以将血液直接滴入Eppendorf管中的部位；通过这种方法，可以在2分钟内从小鼠收集最多200微升的血液。

2.    可以通过穿刺上颌窦采样，用毛细管管或巴斯德吸管穿透上颌窦来采集小鼠和大鼠的样品。使用巴斯德吸管可以采集更多的血液，最多可达0.5mL。在重新从同一个眼眶采样之前，应该至少等待10天进行组织修复，否则愈合过程可能会影响血液流动。

3.    下颌下静脉毛细管采血不需要麻醉，可以作为小鼠的采集部位。使用小刀刺破面部静脉，然后使用毛细管管或巴斯德吸管采集血液。

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